La calcificación vascular medial (CV) es una condición prevalente, especialmente en la edad avanzada y la enfermedad renal crónica (ERC), asociada con un mayor riesgo cardiovascular y mortalidad. Las células de músculo liso vascular (CMLV) juegan un papel clave en este proceso, que puede ser exacerbado por la inflamación y la senescencia celular. Este estudio investigó el impacto de la fisetina, un flavonol con propiedades antiinflamatorias y senolíticas, en la calcificación de las CMLV para explorar su potencial como agente anti-calcificante.
La calcificación vascular (CV) medial, una condición prevalente asociada con el envejecimiento y la enfermedad renal crónica (ERC), eleva significativamente el riesgo de eventos cardiovasculares y mortalidad. Este complejo proceso implica la participación activa de las células de músculo liso vascular (CMLV), que pueden ser influenciadas por la inflamación y la senescencia celular. Por lo tanto, este estudio investiga el impacto de la fisetina, un flavonol conocido por sus propiedades antiinflamatorias y senolíticas, en la calcificación de las CMLV.
Para comenzar, el estudio examinó los efectos de la fisetina sobre la calcificación de las CMLV en condiciones pro-calcificantes. Se realizaron experimentos en CMLV aórticas humanas primarias cultivadas, exponiéndolas a un medio de calcificación (calcio y β-glicerofosfato) en presencia de diferentes concentraciones de fisetina (0-20 μM). Los resultados, como se ilustra en la Figura 1, revelaron que el tratamiento con fisetina suprimió la expresión de marcadores calcíficos, específicamente el ARNm de BMP2 y ALPL, de manera dependiente de la dosis. Una concentración de 1 μM de fisetina redujo significativamente la regulación positiva de estos marcadores inducida por el medio de calcificación. Concentraciones más bajas de fisetina no mostraron un efecto significativo.
Una investigación adicional profundizó en los efectos de la fisetina en otras vías de señalización pro-calcificantes. Como se muestra en la Figura 2, el aumento inducido por el medio de calcificación de marcadores pro-calcificantes como CBFA1, SP7, BGLAP y la expresión de ARNm de SPP1, junto con la actividad de ALP y la localización nuclear de CBFA1, fueron suprimidos por la suplementación con 1 μM de fisetina. Esto indica que la fisetina no solo afecta la expresión de marcadores calcíficos específicos, sino que también modula la cascada de señalización pro-calcificante más amplia. Además, la fisetina redujo la expresión de marcadores asociados con la senescencia de las CMLV, como CDKN1A y GLB1, así como la tinción de β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA) (Figura Suplementaria 2), lo que sugiere un potencial efecto senolítico.
El estudio luego evaluó el impacto de la fisetina en el proceso real de calcificación. La Figura 3 demuestra que el cotratamiento con 1 μM de fisetina redujo significativamente la calcificación de las CMLV expuestas al medio de calcificación, como lo demuestra la imagen de fluorescencia de Osteosense y una disminución en el contenido de calcio. Estos hallazgos demuestran colectivamente que la fisetina inhibe la señalización pro-calcificante y la posterior calcificación de las CMLV inducida por el estrés mineral.
Para comprender los mecanismos subyacentes de los efectos anti-calcificantes de la fisetina, el estudio exploró su interacción con la vía p38 MAPK. La Figura 4 ilustra que el medio de calcificación indujo la fosforilación de p38 MAPK en las CMLV, un proceso significativamente atenuado por la fisetina. Esto sugiere que las propiedades anti-calcificantes de la fisetina pueden estar mediadas, al menos en parte, a través de la inhibición de la activación de p38 MAPK.
El estudio luego se centró en la fosfatasa de doble especificidad 1 (DUSP1), un regulador negativo de la actividad de p38 MAPK. Como se muestra en la Figura 5, la fisetina aumentó la abundancia total de la proteína DUSP1 en las CMLV, así como la fosforilación de DUSP1 en Ser359, un sitio que puede inhibir la degradación de DUSP1. Además, la fisetina aumentó la abundancia de la proteína p44/42 MAPK fosforilada y total en las CMLV (Figura Suplementaria 5). Estos resultados sugieren que la fisetina influye en la vía DUSP1, lo que podría conducir a la inactivación de p38 MAPK.
Para investigar más a fondo el papel de DUSP1, el estudio empleó técnicas de silenciamiento génico. La Figura 6 demuestra que la inactivación de DUSP1 por sí sola fue suficiente para regular significativamente la expresión de ARNm de marcadores pro-calcificantes en las CMLV. Además, el silenciamiento de DUSP1 abolió los efectos protectores de la fisetina durante las condiciones pro-calcificantes. En consecuencia, el silenciamiento de DUSP1 agravó la calcificación de las CMLV inducida por el medio de calcificación y prácticamente abolió las propiedades anti-calcificantes de la fisetina (Figura 7). Estos hallazgos sugieren fuertemente que DUSP1 es crucial para los efectos anti-calcificantes de la fisetina.
Se obtuvo evidencia adicional que respalda el papel de DUSP1 en la señalización de p38 MAPK a través de experimentos adicionales. Como se muestra en la Figura 8, la inactivación de DUSP1 aumentó la fosforilación de p38 MAPK en las CMLV. La inhibición farmacológica de p38 MAPK con SB203580 atenuó significativamente la mayor expresión de marcadores pro-calcificantes en las CMLV con silenciamiento de DUSP1. Esto confirma que la inactivación de DUSP1 aumenta la señalización pro-calcificante dependiente de p38 MAPK, agravando así la calcificación de las CMLV.
El estudio también exploró los efectos de la fisetina en condiciones urémicas. La Figura 9 revela que la exposición de las CMLV al suero urémico de pacientes con hemodiálisis aumentó significativamente la expresión de marcadores pro-calcificantes. Sin embargo, el tratamiento con fisetina suprimió significativamente la expresión inducida por el suero urémico de ARNm de BMP2, CBFA1 y CDKN1A, lo que indica que la fisetina ejerce efectos protectores en las CMLV en condiciones urémicas.
Para validar aún más las propiedades anti-calcificantes de la fisetina, se realizaron experimentos ex vivo en explantes aórticos de ratón. La Figura 10 muestra que la fisetina redujo la calcificación y la mayor expresión de ARNm de marcadores pro-calcificantes inducidos por la exposición al fosfato en explantes aórticos de ratón. Además, la fisetina redujo significativamente la abundancia de p38 Mapk fosforilada en explantes aórticos de ratón durante condiciones de alto fosfato (Figura Suplementaria 11).
Finalmente, el estudio investigó los efectos de la fisetina in vivo utilizando un modelo de ratón de CV inducida por colecalciferol. Como se muestra en la Figura 11, el tratamiento con fisetina redujo significativamente la calcificación aórtica, como lo demuestra la tinción con Rojo de Alizarina y la cuantificación del contenido de calcio. Además, la fisetina suprimió la expresión inducida por colecalciferol de marcadores pro-calcificantes en tejidos aórticos.
En conclusión, este estudio revela un papel novedoso para la fisetina como un potente agente protector contra la calcificación de las CMLV inducida por fosfato. El mecanismo implica la regulación de la señalización pro-calcificante dependiente de p38 MAPK mediada por DUSP1 (Figura 12). La fisetina, al inducir DUSP1, inactiva la señalización de p38 MAPK, inhibiendo así la señalización pro-calcificante y la calcificación de las CMLV. Este trabajo destaca el potencial de la fisetina como agente terapéutico para la calcificación vascular, particularmente en el contexto de la enfermedad renal crónica.
La fisetina inhibe eficazmente la calcificación de las células del músculo liso vascular a través de la regulación de p38 MAPK mediada por DUSP1, mostrando potencial como agente terapéutico para la calcificación vascular asociada con la enfermedad renal crónica y el envejecimiento. Se justifica una investigación adicional para explorar su potencial traslacional y optimizar su aplicación en entornos clínicos.
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