La naturaleza dinámica de las modificaciones epigenéticas se ha aprovechado para construir relojes epigenéticos que predicen con precisión la edad de un individuo basándose en los niveles de metilación del ADN. Aquí exploramos si la acumulación de epimutaciones, que se puede cuantificar mediante la entropía de Shannon, cambia de forma reproducible con la edad.
Las modificaciones epigenéticas, particularmente la metilación del ADN, juegan un papel crucial en la diferenciación y función celular, a pesar de que todas las células somáticas comparten el mismo genoma. Esto se logra a través de cambios covalentes en el ADN que influyen en la expresión génica de manera específica para cada tipo de célula. La más estudiada de estas modificaciones es la metilación de la citosina, principalmente en los dinucleótidos CpG, un proceso catalizado por las ADN metiltransferasas. Se sabe que la metilación de las islas CpG dentro de las regiones reguladoras suprime la expresión génica, lo que resalta la importancia funcional de esta marca epigenética.
Más allá de su papel en el desarrollo, la metilación del ADN se ha relacionado cada vez más con el proceso de envejecimiento. Los estudios han demostrado que los patrones de metilación de muchas islas CpG están positivamente correlacionados con la edad, mientras que otros loci fuera de las islas CpG muestran correlaciones negativas. Además, se ha observado que los promotores dentro de los dominios de cromatina bivalente en la sangre se hipermetilan con la edad. Estos loci a menudo están asociados con genes de desarrollo y también se hipermetilan comúnmente en los cánceres, lo que sugiere un posible vínculo mecanicista entre la hipermetilación aberrante, el cáncer y el envejecimiento. Estas alteraciones relacionadas con la edad en la metilación del ADN se conocen colectivamente como deriva epigenética.
El fenómeno de la deriva epigenética ha allanado el camino para el desarrollo de relojes epigenéticos, que tienen como objetivo predecir la edad de un organismo basándose en su perfil de metilación. Los primeros ejemplos, como el reloj basado en sangre de Hannum et al. y el reloj multi-tejido de Horvath, han demostrado una precisión notable, logrando correlaciones con la edad cronológica que superan r=0,90. Sobre la base de esto, los datos de metilación del ADN también se han utilizado para crear biomarcadores epigenéticos capaces de predecir la esperanza de vida y los cambios fisiológicos relacionados con la edad, lo que subraya aún más la utilidad de la información epigenética para comprender y cuantificar el envejecimiento.
Si bien el envejecimiento es un proceso complejo y no totalmente comprendido, investigaciones recientes destacan el papel significativo del daño celular y la consiguiente pérdida de información epigenética en la senescencia. Un estudio convincente de Yang et al. introdujo un sistema llamado “ICE” que indujo roturas de ADN de doble cadena en ratones, acelerando tanto el envejecimiento fisiológico como el epigenético sin causar mutaciones. En particular, los síntomas del envejecimiento se revirtieron al expresar un subconjunto de factores de Yamanka, lo que sugiere un potencial para la reprogramación epigenética para contrarrestar el envejecimiento. Otro estudio en ratones encontró que los patrones de metilación de las islas CpG estaban más ordenados en las células madre de los tejidos de proliferación lenta en comparación con los tejidos de proliferación rápida, lo que respalda la idea de que los eventos de metilación del ADN se acumulan estocásticamente con el tiempo y pueden servir como biomarcador del envejecimiento. Sin embargo, la medida en que esta pérdida de información epigenética puede predecir la edad cronológica en humanos y cómo este enfoque se compara con los métodos tradicionales de análisis epigenético sigue siendo una pregunta abierta.
Los métodos tradicionales para medir la metilación del ADN a menudo se han basado en técnicas como los microarrays de metilación, que miden los niveles de metilación en los CpG individuales. Otro enfoque común es la secuenciación de bisulfito, que cuantifica la metilación en función de la tasa de conversión de citosina a timina. La secuenciación de bisulfito ofrece la ventaja de capturar los estados de metilación en los CpG dentro de las lecturas completas, lo que permite métodos de cuantificación que tienen en cuenta la heterogeneidad dentro de las poblaciones celulares. Por ejemplo, se ha demostrado que la métrica de metilación clonal ajustada a la heterogeneidad celular (CHALM), derivada de los datos de secuenciación de bisulfito, se correlaciona mejor con la expresión génica que los niveles de metilación de una sola citosina. Sin embargo, ni la metilación promedio ni CHALM cuantifican directamente la diversidad de los patrones de metilación en las moléculas individuales de ADN.
Para profundizar en los patrones de metilación del ADN relacionados con la edad, los investigadores de este estudio emplearon la secuenciación de bisulfito dirigida (TBS) en muestras de hisopos bucales humanos. TBS permite la medición de los patrones de metilación del ADN en las lecturas, lo que permite la enumeración de patrones de metilación distintos en loci específicos. Esta capacidad es crucial para calcular la entropía, o distribución, de estos patrones. El estudio tuvo como objetivo investigar cómo cambia la entropía de metilación con la edad en loci específicos y comparar estos cambios con los cambios asociados a la edad en la metilación de sitios individuales. En última instancia, buscaron determinar el poder predictivo de estas métricas para la edad cronológica utilizando métodos de regresión penalizada.
El estudio recopiló hisopos bucales de 100 individuos que abarcaban un amplio rango de edad (7,2 a 84 años) para generar perfiles de metilación del ADN utilizando la secuenciación de bisulfito dirigida. El panel objetivo comprendía aproximadamente 3000 regiones conocidas por contener sitios CpG asociados a la edad identificados en relojes epigenéticos anteriores. Cada sonda cubría una región ligeramente más grande que su longitud de 120 pares de bases, y los investigadores lograron una cobertura promedio de 293 lecturas por muestra en estas regiones. Las lecturas de cada muestra se alinearon con los loci objetivo y se refinaron múltiples alineaciones para un análisis preciso.
Los investigadores calcularon tres métricas diferentes para cuantificar la metilación del ADN: la metilación media de cada sitio CpG dentro de cada locus, la metilación clonal ajustada a la heterogeneidad celular (CHALM) y la entropía de metilación. Para la entropía de metilación, se centraron en los cuatro sitios CpG con mayor cobertura dentro de cada región. Con cuatro sitios CpG, existen 16 estados de metilación posibles, y se calculó la probabilidad de cada estado para calcular la entropía de Shannon. Estas métricas proporcionaron diferentes perspectivas sobre el panorama de metilación de cada locus.
Al analizar las distribuciones de las correlaciones entre cada métrica y la edad en los 3000 loci, los investigadores encontraron que eran ampliamente similares, con una tendencia hacia correlaciones positivas y valores extremos que oscilaban entre -0,6 y 0,8. Las distribuciones de las correlaciones para la metilación promedio, CHALM y la entropía de metilación con la edad fueron aproximadamente normales. Este análisis inicial sugirió que las tres métricas capturan algún aspecto de los cambios relacionados con la edad en la metilación del ADN.
La comparación adicional de las tres métricas en los loci reveló relaciones interesantes. Los cambios relacionados con la edad en la metilación media y CHALM estaban fuertemente correlacionados (r=0,90), lo que indica que estas dos métricas capturan información similar sobre los niveles de metilación. Sin embargo, los diagramas de dispersión que comparan la entropía con la metilación media o CHALM mostraron patrones más complejos, incluidas tendencias tanto positivas como negativas. Una relación diagonal positiva prominente sugirió que muchos loci exhiben aumentos tanto en la entropía como en la metilación media con la edad. Por el contrario, los loci en el cuadrante inferior izquierdo parecían desmetilarse con la edad, lo que resultaba en patrones de metilación menos desordenados. La presencia de un patrón diagonal negativo indicó loci que pierden metilación con la edad mientras se vuelven más aleatorios, así como loci que ganan metilación con la edad y se vuelven más ordenados. Esto demostró que la entropía de metilación proporciona una medida distinta en comparación con la metilación media y CHALM, y que los loci pueden volverse más o menos desordenados con la edad, independientemente de la dirección del cambio de metilación.
Para obtener una comprensión más profunda de estas tendencias globales, los investigadores se centraron en dos loci específicos que exhibían correlaciones extremas entre la entropía y la edad. El locus en chr15:51681883-51681783 mostró una alta correlación positiva con la entropía (0,79) y la metilación promedio (0,82). El análisis de los patrones de metilación en este locus en una muestra joven (7,2 años) reveló lecturas predominantemente hipometiladas, mientras que una muestra más antigua (84,4 años) mostró una distribución mucho más amplia de patrones de metilación distintos, incluida una cantidad sustancial de lecturas parcialmente metiladas, aunque el patrón totalmente desmetilado siguió siendo el más prominente.
Por el contrario, el locus en chr2:101001739-101001859 exhibió una prominente correlación negativa entre la entropía y la edad (-0,63) pero una alta correlación positiva entre la metilación promedio y la edad (0,73). Como se anticipó, la muestra joven en este locus mostró una mayor variedad de patrones de metilación distintos, mientras que la muestra antigua estaba dominada por patrones totalmente metilados. Estos ejemplos ilustran visualmente cómo la entropía captura la diversidad de los estados de metilación dentro de un locus y cómo esta diversidad puede cambiar con la edad de diferentes maneras, a veces aumentando y a veces disminuyendo, independientemente del nivel general de metilación.
Para evaluar el poder predictivo de estas métricas para la edad cronológica, los investigadores construyeron relojes epigenéticos utilizando la metilación promedio, CHALM y la entropía por separado, así como una combinación de las tres. Emplearon dos métodos de regresión diferentes: la regresión de red elástica y la regresión de red neuronal. El rendimiento de los relojes se evaluó utilizando la validación cruzada de dejar uno fuera, midiendo la correlación de Pearson entre la edad predicha y la real y el error absoluto medio (MAE).
Los resultados mostraron que los coeficientes de correlación de Pearson entre las edades predichas y las reales oscilaron entre 0,79 y 0,93, y el MAE osciló entre 4,81 y 7,56 años. La regresión de red elástica produjo consistentemente modelos con valores de correlación superiores a 0,9 y MAE inferiores a 6 años para todas las métricas. El número promedio de loci incluidos en los modelos de red elástica después de la regularización varió ligeramente según la métrica utilizada. Por el contrario, la regresión de red neuronal produjo modelos con mayor variabilidad en el rendimiento. Si bien las métricas basadas en la media (metilación promedio y CHALM) resultaron en coeficientes de correlación más bajos (por debajo de 0,9) y un MAE más alto (mayor de 7 años) con la regresión de red neuronal, los modelos que utilizaban la entropía y una combinación de las tres métricas lograron coeficientes de correlación superiores a 0,9 y el MAE más bajo entre todos los modelos.
Los modelos de regresión de red elástica exhibieron una tendencia a sobreestimar la edad de las muestras jóvenes y subestimar la edad de las muestras antiguas, una característica menos pronunciada en los modelos de red neuronal. Esta diferencia es probablemente atribuible a la mayor flexibilidad de las redes neuronales para capturar relaciones complejas en comparación con la regresión de red elástica. Para evaluar sus relojes, los investigadores también entrenaron un reloj utilizando los niveles de metilación de los sitios CpG individuales del reloj epigenético de Horvath que se superponían con sus datos. Este modelo de referencia, entrenado con los niveles de metilación promedio en 325 sitios CpG compartidos utilizando la regresión de red elástica, produjo una correlación de 0,85 y un MAE de 7,11 años, comparable a sus modelos basados en la metilación media. Estos hallazgos sugieren colectivamente que, particularmente con la regresión de red neuronal, los modelos que incorporan la entropía de metilación pueden predecir eficazmente la edad cronológica basada en datos epigenéticos, logrando potencialmente una calidad de predicción similar o incluso ligeramente mejor que los modelos que se basan únicamente en métricas de metilación basadas en la media. El estudio también sugiere que la combinación de la entropía de metilación con métricas basadas en la media puede maximizar el rendimiento del modelo.
En resumen, este estudio investigó la utilidad de múltiples métricas para cuantificar los cambios asociados a la edad en la metilación del ADN, yendo más allá de las mediciones tradicionales de un solo nucleótido para incorporar métricas basadas en lecturas como CHALM y, notablemente, la entropía de Shannon. Al emplear la secuenciación de bisulfito dirigida en muestras de hisopos bucales humanos, los investigadores pudieron medir los patrones de metilación en los sitios CpG dentro de las mismas lecturas, lo que permitió el cálculo de estas métricas avanzadas. Sus hallazgos demuestran que, si bien la metilación media y CHALM capturan aspectos similares de los cambios de metilación relacionados con la edad, la entropía proporciona una medida distinta de la diversidad de los estados de metilación dentro de un locus. Las complejas relaciones observadas entre la entropía y la edad, donde la entropía puede aumentar o disminuir independientemente de los niveles de metilación, resaltan la información única capturada por esta métrica. Además, los resultados del estudio indican que los relojes epigenéticos que incorporan la entropía de metilación, particularmente cuando se utiliza la regresión de red neuronal, pueden predecir con precisión la edad cronológica, lo que respalda la noción de que el contenido de información epigenética cambia de forma reproducible con la edad. Este trabajo subraya el potencial de la entropía de metilación como un valioso biomarcador para el envejecimiento y sugiere que las mediciones de metilación basadas en la secuencia, que permiten el análisis de los patrones de metilación, ofrecen una fuente más rica de información para comprender el panorama epigenético del envejecimiento.
Esta investigación demuestra que la entropía de la metilación del ADN, junto con las mediciones tradicionales de metilación, puede predecir con precisión la edad cronológica, lo que sugiere un papel más amplio de la información epigenética en el envejecimiento. Estos hallazgos resaltan el potencial de los biomarcadores basados en la entropía para comprender y potencialmente intervenir en el proceso de envejecimiento, impulsando una mayor investigación sobre la interacción entre la estabilidad epigenética y los cambios relacionados con la edad.